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                          檢測ATCC細胞
                          點擊次數:1276 更新時間:2018-11-02

                           

                          用了許多方法檢測小鼠的肝臟、腦部、睪丸等組織的細胞凋亡,其中 TUNEL 法做的多,我購買的試劑盒主要是 roche、 promega 公司,結果大多數成功,偶爾也有失敗,下面我把實驗中的關鍵問題與大家共享一下,同時也希望能對初學者有所幫忙。

                          ATCC細胞 TUNEL實驗中關鍵步驟

                          1.充分脫蠟和水化

                          脫蠟可以先 60oC 20 min;而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,這些以便后面的結合反應充分、均勻;

                          2.把握好細胞通透的時間

                          一般根據切片的厚薄,選擇蛋白酶k的孵育時間,常用 10-30 min,幾 μm 切片用短時間;幾十 μm 切片用長時間,通過摸索達到既不脫片,有能夠使后面的酶和抗體進入胞內。

                          3.適當延長 TUNEL 反應液的時間

                          一般是37oC 1 h,你也可以根據你的凋亡損傷程度,選擇更長的時間,可長至 2 h,但要結合你終的背景著色。

                          4.DAB 顯色條件的選擇

                          一般 DAB 反應10 min 左右,結合鏡下控制背景顏色,長不超過 30 min;promega 公司提供的 DAB 液(桃紅色),不利于辨認棕褐色,我不太喜歡。

                          5.PBS 的充分清洗

                          在 TUNEL 反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格,可增加次數達 5 次,因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著色。

                          6.內源性 POD 的封閉

                          對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織,我的經驗是適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度,可以達到很好的封閉效果,且不影響終的特異性染色。

                          TUNEL法的實驗原理

                                ATCC細胞 基本原理:對不同組織切片先增加細胞膜通透性,然后讓 rTDT 和生物標記的 dTUTP 進入細胞內,在 rTDT 的輔助下 dTUTP 與核斷裂的 DNA 3’-OH 結合,再用 HRP 標記的鏈霉親和素與 dTUTP 上的 biotin 結合(每個鏈霉親和素至少可以再結合 3 個 biotin 分子),后用 DAB、過氧化氫與 SP 上的辣根過氧化物酶HRP發生氧化、環化反應,形成苯乙肼聚合物而呈現棕褐色,終通過計數每張切片上不同視野中 TUNEL 陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發生情況。(小編碎碎念:掌握原理是做好實驗的先決條件,不少人還以為是抗體抗原反應呢)

                                 細胞通透的時間選擇

                                 1.蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜,從而使反應試劑充分進入細胞核進行反應,提高陽性率。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片,只要不脫片,好像影響不大,其作用類似與 TritonX100 等細胞通透劑。

                                 2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml,可用 PBS 配制,也可用蛋白酶K緩沖液(100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA);然后分裝成小份,用完一支再用下一支,-20oC保存 1 個月應該沒問題的(重復拿的那支),而一直冷凍的至少可以用半年以上。

                                 3. 蛋白酶K反應時間一般為10-30 min,具體時間長短與切片厚薄有關,4 μm左右的片子可以用 10 min,但30 μm左右的可用30 min,終通過摸索jia時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。

                          關鍵試劑操作條件

                                 DAB 顯色反應大約需要10 min,要控制好反應時間,勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據切片組織來源和切片厚度、試劑盒種類不同來摸索一下。

                          蛋白酶K工作液處理時間、溫度須在范圍內摸索,溫度過高,時間過長,易破壞核酸結構,出現假陽性。

                                 DNase 1 一般室溫,10 min 即可。

                           如何減弱非特異性染色

                                 若是肝臟或腎臟,因富含內源性過氧化物酶,需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時間、PBS 充分清洗,注意鏡下把握好著色。

                          其他注意事項

                                 1.濕盒用帶蓋方盤,里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片,使用時稍加水即可。

                                 2.英文說明書中對組織細胞通透這一步中,加了“對難處理的組織的處理”,意思是用常規方法處理(如蛋白酶 K)后,應該陽性而做不出陽性時,可用微波修復。

                                 3.復染的目的是為了襯托組織形態結構,以利于結果分析,石蠟切片常用蘇木素,核染成蘭色,冷凍切片常用甲基綠,核染成綠色。

                                 4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制,現在有賣的,自己加蒸餾水稀釋后即可用,很方便,也不貴。蛋白酶 K 消化蛋白后,需要用封閉液。

                                 5. 未打開的試劑盒貯存在-20℃(-15~25℃);converter -POD液一旦解凍,以后就保存在4℃(2~8℃)下,至少在6 m內穩定,避免再次凍存;TUNEL反應液臨用前配好后,放至冰上直至使用。

                                 6. 結果分析時注意:在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產生大量DNA斷,從而引起假陽性結果;而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內反應,進而產生假陰性結果

                                 7.棕色是陽性細胞沒錯;棕色+藍色的細胞核為藍黑色,趨黑色,所以是可以判斷的。如果結果片子全是藍色的,那就是說沒有陽性細胞核。實驗失敗。陽性細胞核可以被染上,只不過是藍黑色而已。注意分辨。Tunel后鏡檢一下看看陽性細胞核在什么位置;然后再輕度復染即可。注意比較分辨哪些是陽性細胞。

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